Linhagens de células tronco embrionárias (células ES - do inglês embryonic stem) são células não diferenciadas,derivadas do botão embrionário de blastócistos, que têm como característica principal pluripotência (Evans e Kaufman, 1981; Martin, 1981) (Figura 1a, b). Ou seja, quando reintroduzidas em um blastocisto, as células ES possuem capacidade de retomar o desenvolvimento normal, colonizando diferentes tecidos do embrião, incluída a linhagem germinativa. Somente aquelas linhagens de células ES capazes de colonizar a linhagem germinativa de um embrião são consideradas altamente pluripotentes.
Quando cultivadas em condições específicas, as células ES podem ser mantidas em seu estado não diferenciado por múltiplas divisões celulares.
Por outro lado, essas células podem ser induzidas a iniciar um programa de diferenciação in vitro. Por exemplo, quando cultivadas em suspensão, as células ES formam espontaneamente agregados de células diferenciadas chamados .corpos embrióides.
(Ebs - do inglês, .embryoid bodies.), que simulam o desenvolvimento de um embrião pré-implantado. Através de análises morfológicas, imuno-histoquímicas e moleculares, encontrase uma grande variedade de linhagens embrionárias dentro dos EBs . hematopoética, neuronal, endotelial, cardíaca e muscular (Ling e Neben,1997) (Figura 1c, d).
Essas propriedades das células ESlevaram ao seu uso como modelo in vitro de desenvolvimento embrionário precoce. Nelas, podem ser estudados os mecanismos de diferenciação celular, o processo de iniciação da inativação do cromossomo X, e os efeitos de substâncias tóxicas e biologicamente ativas no desenvolvimento embrionário in vitro.
Linhagens de células tronco embrionárias (células ES - do inglês embryonic stem) são células não diferenciadas,derivadas do botão embrionário de blastócistos, que têm como característica principal pluripotência (Evans e Kaufman, 1981; Martin, 1981) (Figura 1a, b). Ou seja, quando reintroduzidas em um blastocisto, as células ES possuem capacidade de retomar o desenvolvimento normal, colonizando diferentes tecidos do embrião, incluída a linhagem germinativa. Somente aquelas linhagens de células ES capazes de colonizar a linhagem germinativa de um embrião são consideradas altamente pluripotentes.
Quando cultivadas em condições específicas, as células ES podem ser mantidas em seu estado não diferenciado por múltiplas divisões celulares.
Por outro lado, essas células podem ser induzidas a iniciar um programa de diferenciação in vitro. Por exemplo, quando cultivadas em suspensão, as células ES formam espontaneamente agregados de células diferenciadas chamados .corpos embrióides.
(Ebs - do inglês, .embryoid bodies.), que simulam o desenvolvimento de um embrião pré-implantado. Através de análises morfológicas, imuno-histoquímicas e moleculares, encontrase uma grande variedade de linhagens embrionárias dentro dos EBs . hematopoética, neuronal, endotelial, cardíaca e muscular (Ling e Neben,1997)
(Figura 1c, d).
Essas propriedades das células ESlevaram ao seu uso como modelo in vitro de desenvolvimento embrionário precoce. Nelas, podem ser estudados os mecanismos de diferenciação celular, o processo de iniciação da inativação do cromossomo X, e os efeitos de substâncias tóxicas e biologicamente ativas no desenvolvimento embrionário in vitro.
Modelos animais para doenças genéticas humanas: Nos últimos anos, células ES vêem sendo utilizadas para produzir camundongos transgênicos e modelos animais de doenças genéticas humanas. Esses modelos animais são importantes ferramentas para o estudo das patologias associadas uma doença específica, além de servirem como um sistema no qual podem ser testadas, novas terapias. O recente desenvolvimento de técnicas de manipulação do genoma de camundongos faz do camundongo transgênico o melhor sistema disponível para o estudo de doenças genéticas humanas (Capecchi,1989). A propagação pela linhagem germinativa de DNA microinjetado no pronúcleo de ovos fertilizados de camundongos foi descrita, pela primeira vez, em 1980 (Gordon et al., 1980). Essa metodologia faz com que várias cópias do transgene injetado se integrem em tandem em um sítio aleatório no genoma e sejam transmitidas de forma Mendeliana. Desde então, a microinjeção pronuclear tem sido utilizada geração de modelos animais para várias doenças genéticas dominantes, incluindo osteogenesis imperfecta (Bonadio et al., 1990), através da inserção de um alelo mutado -transgene - no genoma do camundongo. No entanto, esse método apresenta algumas limitações. Por causa do sítio aleatório de integração do transgene, este poderá não estar sob o controle de todos os elementos em cis que controlam a expressão do gene endógeno. Assim, a expressão temporal e espacial do transgene não seguirá o padrão de expressão do gene endógeno. Além disso, a introdução de um terceiro alelo - o transgene mutante - cria uma situação artificial no que diz respeito à proporção entre os transcritos normais e os mutantes. Enquanto uma pessoa com uma doença genética dominante possui um alelo normal e um mutado, o camundongo transgênico possuirá dois alelos endógenos normais e diversas cópias do alelo mutante (transgene). Essa proporção pode ser crítica em doenças suscetíveis a efeitos de dosagem gênica.
Figura 2: Recombinação homóloga. Exons estão representados por retângulos, íntrons por linhas azuis. O vetor de recombinação homóloga possui duas regiões de homologia ao gene alvo (homol. 5. e 3.). O pareamento dessas regiões com as regiões homólogas do lócus endógeno permite que duas recombinações recíprocas levem à substituição de um exon (cinza) pela cassete de expressão neo. A detecção do evento de recombinação homóloga é feita por Southernblot de DNA genômico das colônias de células ES. Uma sonda externa à região de homologia (barra verde) é utilizada em DNA digerido com a enzima de restrição EcoRI (E). A substituição do exon por neo introduz um sítio de EcoRI no locus, gerando uma banda menor referente ao alelo mutado. Uma colônia recombinante é detectada (*)
Manipulação do genoma do camundongo através de células ES:
Recentemente, a combinação do cultivo de células ES e da recombinação homóloga resultou na criação de um método alternativo e mais preciso para manipular o genoma do camundongo.
As células ES podem ser modificadas geneticamente, em cultura, através da recombinação homóloga, processo que promove a substituição do alelo normal de um gene específico pela versão mutada do mesmo gene, construída no laboratório (Figura 2). Dessa forma, são obtidas linhagens de células ES geneticamente modificadas. Essas são agregadas a mórulas de camundongos in vitro e, assim, incorporadas ao embrião (Figura3). Os camundongos resultantes serão quimeras formadas de células do embrião recipiente e das células ES recombinantes. Se essas últimas colonizarem a linhagem germinativa dos animais quiméricos, a mutação será então transmitida às novas gerações de camundongos (Figura 4). A capacidade de modificar regiões específicas do genoma do camundongo por recombinação homóloga permite a criação em potencial de camundongos com qualquer genótipo desejado.O vetor mais comumente usado para recombinação homóloga é o chamado vetor de substituição de seqüência, que contém o gene de resistência à neomicina (neo) flanqueado por seqüências homólogas ao gene alvo (Capecchi,1989) (Figura 2). Através de dois eventos de recombinação recíprocos, esse tipo de vetor media a substituição das seqüências endógenas de DNA pelas seqüências exógenas contidas no vetor (Figura 2). Assim, são criadas mutações em loci específicos do genoma do camundongo.
Mutação condicional -sistema
CRE-loxP: Outro tipo de vetor desenvolvido ainda mais recentemente utiliza o sistema de recombinação em bactérias CRE-loxP (Chambers, 1994). Nesse microorganismo, duas seqüências específicas de 38 pb, denominadas loxP, são reconhecidas pela proteína CRE do bacteriófago P1. Por meio da recombinação entre duas sequências loxP, a proteína CRE promove a remoção da seqüência de DNA dentre estas sequências,resultando em uma deleção. O sistema CRE-loxP pode ser usado junto com a recombinação homóloga para se criarem mutações no genoma do camundongo (Chambers,1994). Nesse caso, o vetor de recombinação contém, além da cassete de expressão neo, duas seqüências loxP delimitando a região a ser deletada (Figura 5). O primeiro evento de recombinação homóloga introduzirá as seqüências loxP nos sítios específicos do gene alvo. Um segundo evento de recombinação, mediado pela proteína CRE, levará à deleção a região do alelo recombinante flanqueada pelas seqüências loxP. A recombinação mediada por CRE pode ser feita ainda nas células ES em cultura, através da expressão transiente de CRE que há nelas. Uma vantagem desse sistema é que, com ele, o geneneo não fica inserido no gene alvo. A presença de neo em íntrons de genes pode introduzir seqüências que atrapalhem o splicing correto do gene alvo, ou que, de alguma ou outra forma, diminuam o nível de expressão do alelo mutado ou de genes na sua proximidade. Esse tipo de efeito já foi descrito em alguns genes (Pereira et al., 1997; Pereira et al., 1999). Alternativamente, o segundo evento de recombinação pode ser realizado in vivo. Dessa forma, controlando-se o padrão temporal e o espacial da expressão de CRE, podese controlar o período de desenvolvimento e os tecidos onde a mutação será induzida, o que chamamos de mutação condicional. Esse sistema é utilizado quando se deseja estudar o efeito de mutações que são letais quando presentes desde a concepção ou em todos os tecidos do animal. A combinação dessas estratégias de manipulação do genoma do camundongo, quando realizadas em células ES, permitem a criação de linhagens de animais mutantes.
Estabelecimento de novas linhagens de células ES:
Um parâmetro crítico para uso de células ES na geração de modelos animais é a sua pluripotência, que pode ser perdida durante o cultivo prolongado. O uso de linhagens envelhecidas dessas células pode levar a uma baixa freqüência de recombinação homóloga e à não colonização da linhagem germinativa de animais quiméricos (Nagy e Rossant, 1993).
Células ES murinas comerciais sãoUm parâmetro crítico para uso de células ES na geração de modelos animais é a sua pluripotência, que pode ser perdida durante o cultivo prolongado. O uso de linhagens envelhecidas dessas células pode levar a uma baixa freqüência de recombinação homóloga e à não colonização da linhagem germinativa de animais quiméricos (Nagy e Rossant, 1993). Células ES murinas comerciais são caras e podem ser usadas durante um tempo limitado, por já estarem em cultivo há a um período relativamente longo. Assim, para a produção a longo prazo de animais transgênicos é fundamental a obtenção de novas linhagens de células ES. Nós estabelecemos três novas linhagens de células
ES a partir do botão embrionário de blastocistos de camundongos 129/Sv (pelagem agouti): USP-1, USP-2 e USP-3. Sua pluripotência foi avaliada in vitro através de testes convencionais.Eles incluíram a cariotipagem das células, a atividade de fosfatase alcalina e a capacidade das células de formarem EBs complexos. Essas três linhagens apresentaram cariótipo 40, XY normal,alta atividade de fosfatase alcalina, e formaram EBs complexos, com diversos tipos celulares e cardiomiócitos pulsantes, demonstrando um alto grau de diferenciação (Figuras 1 e 6). Estas características indicam um alto nível de pluripotência das novas linhagens de células ES USP-1, USP-2 e USP-3. Foi avaliada a capacidade da linhagem
USP-1 de popular a linhagem germinativa de animais quiméricos. Através da agregação e do cocultivo das células USP-1 com mórulas de animais CD-1 (pelagem branca), foram gerados animais quiméricos (Figura 3). O nível de quimerismo, estimado a partir da coloração da pelagem dos animais, variou de 0 a 100%. Os animais mais compostos de células derivadas das células USP-1, de pelagem predominantemente agouti, foram cruzados com fêmeas CD-1 Como a pelagem agouti é dominante sobre a pelagem branca dos animais CD-1, a pelagem agouti da ninhada resultante demonstrou a colonização da linhagem germinativa dos animais quiméricos pela linhagem de células ES USP-1 (Figura 4). Essa linhagem está, no momento, sendo utilizada para gerar um modelo animal para a síndrome de Marfan.
Figura 3: Sistema de recombinação CREloxP. Seqüências loxP estão representadas por triângulos verdes. O primeiro evento de recombinação homóloga introduz os sítios loxP entre o exon a ser deletado. Em um segundo evento, a expressão da proteína CRE irá mediara recombinação entre os dois sítios loxP, deletando a seqüência entre eles. A expressão de CRE pode ser controlada de forma que induza a recombinação somente em tecidos ou estágios de desenvolvimento específicos do camundongo
Geração de um modelo animal para a síndrome de Marfan:
A síndrome de Marfan (SMF) é a mais comum das doenças genéticas tecido conjuntivo. Herdada de forma autossômica dominante, essa síndrome tem uma incidência de, aproximadamente, 1 em 10.000 indivíduos (McKusick, 1955). O fenótipoda SMF é 100% penetrante, e suas manifestações clínicas afetam primariamente três áreas: esquelética (crescimento excessivo dos membros, hiperextensibilidade articular, escoliose e deformidades na região anterior do tórax); ocular (ectopia lentis, miopia e deslocamento da retina); e cardiovascular (dilatação da raíz da aorta, dissecção da aorta, prolapso da válvula mitral e regurgitação mitral). A sobrevida de pacientes com a
SMF é de, aproximadamente, dois terços do normal - 40 anos na média.
Em 90% dos casos, a morte é causada por falha cardiovascular (McKusick,1955). O diagnóstico precoce seguido de intervenção médica leva a um prolongamento da sobrevida.
A SMF é causada por mutações no gene FBN1. Esse gene codifica a fibrilina-1, componente estrutural mais abundante das microfibras na matriz extracelular. As microfibras estão largamente distribuídas pelo organismo e se encontram associadas à elastina nas fibras elásticas. Acredita-se que mutações no gene FBN1 geram o fenótipo da SMF através do modelo dominante-negativo (Dietz et al., 1993). Segundo esse modelo, proteínas mutantes interagem com as fibrilinas normais, incorporando-se às microfibras e perturbando, assim, sua organização e integridade. Ainda de acordo com esse modelo, os indivíduos portadores de um alelo mutante com uma expressão de fibrilina-1 mais baixa podem apresentar um fenótipo menos severo da doença devido à prevalência de fibrilinas normais produzidas a partir do alelo normal (Pereira et al., 1997).
A identificação de uma proteína altamente homóloga à fibrilina-1, denominada fibrilina-2, levou à classificação destas como uma nova família de proteínas extracelulares: fibrilina 1, produto do gene FBN1; e fibrilina- 2, produto do gene FBN2. Estudos dos padrões de expressão desses dois genes durante a embriogenia mostram que estes são expressos de maneiras diferentes, tanto em termos de distribuição em tecidos quanto de estágios de desenvolvimento (Zhang et al., 1995). Em geral, mRNAs da fibrilina-2 aparecem mais cedo e se acumulam por um período mais curto de tempo do que os da fibrilina-1. Síntese de fibrilina-1 está relacionada com o período mais tardio da morfogênese e com o aparecimento de estruturas mais definidas.
Por outro lado, a síntese da fibrilina- 2 coincide com etapas iniciais da morfogenese, em particular com o começo da elastogenese. Logo, as microfibras morfologicamente homogêneas são, na verdade, heterogêneas, no que diz respeito à sua composição por diferentes fibrilinas. Com base nesses resultados, foi proposto que as fibrilinas têm funções distintas, porém relacionadas, na fisiologia das microfibras. Segundo essa teoria, a fibrilina-1 provê principalmente suporte e força, enquanto a fibrilina- 2 tem uma função principal na regulação do processo inicial da formação da fibra elástica (Zhang et al.,1995).
Para estudarmos a função específica de cada fibrilina na formação da fibra elástica e na manutenção da integridade de diversos tecidos, e os mecanismos de patogênese envolvidos na SMF, criamos camundongos com diferentes mutações no gene Fbn1, homólogo ao gene FBN1 humano, através da recombinação homóloga em células ES (Figura 7).
Figura 4: Geração de animais quiméricos. Células ES derivadas de um animal agouti são cocultivadas com mórulas de um animal de pelagem branca. As células se integram ao embrião, e os animais resultantes são quimeras, compostas de células derivadas do embrião receptor e de células derivadas das células ES
Linhagem mgD:
A primeira linhagem (mgDD) possui uma substituição dos exons 19-24 do gene Fbn1 por um cassete de expressão do gene da neomicina (neo) (Pereira et al., 1997) (Figura 7).
Esta mutação levou à produção de monômeros de fibrilina-1 com uma deleção interna, porém, devido à presença de neo no íntron 18, com um nível de expressão 10 vezes menor do que o do alelo normal. Assim, a mutação mgD representa uma combinação de uma mutação estrutural e hipomórfica. Em acordo com o modelo dominante-negativo, animais heterozigotos não apresentam nenhum fenótipo, provavelmente devido ao excesso de fibrilinas normais em relação à forma mutante. Por outro lado, animais homozigotos mgD/mgD morrem de complicações cardiovasculares durante as duas primeiras semanas de vida pós-natal. A histopatologia da parede vascular desses animais é extremamente similar àquela de pacientes com SMF, com a mesma fragmentação das fibras elásticas. Mesmo assim, em tecidos não afetados, as fibras elásticas são morfologicamente normais.
A conclusão mais importante desse estudo foi a de que, mesmo na ausência de fibrilina-1 normal, há formação da fibra elástica (Pereira ET al., 1997). Assim, confirmamos a hipótese de que na verdade, a fibrilina-2 expressa mais cedo, durante o desenvolvimento embrionário, dirige o depósito de elastina na formação da fibra elástica, e que a fibrilina 1 teria um papel posterior na manutenção da integridade e no suporte dessas fibras.
Figura 5: População da linhagem germinativa das quimeras pelas células ES. Animais quiméricos cruzados com fêmeas CD-1 (pelagem branca) deram origem a uma ninhada de animais de pelagem agouti. Isso indica que a linhagem germinativa das quimeras foi populada pelas células ES e, assim, o genótipo dessas células foi transmitido à prole
Linhagem mgR:
O segundo alelo Fbn1 mutante (mgR) foi criado através da inserção do gene neo entre os exons 18 e 19 (Pereira et al., 1999) (Figura 7). Apesar dessa inserção não causar nenhuma perda de seqüência do gene Fbn1, ela leva a uma redução de 5 vezes na expressão do alelo mutado. Assim, o alelo mgR consiste emuma mutação hipomórfica que produz 20% de moléculas de fibrilina- 1 normais. Como esperado, animais heterzigotos mgR/+ são normais. Em contraste, camundongos homozigotos mgR/mgR desenvolvem cifose severa e morrem abruptamente de falha do sistema cardiovascular até os três meses de idade. Esses animais mutantes também apresentam hérnia de diafragma e ossos alongados, similar a pacientes com SMF. A análise histopatológica dos animais mgR/mgR revelou uma participação importante da resposta inflamatória na progressão das manifestações vasculares da mutação (Pereira et al., 1999). Assim, esses estudos sugerem que a inibição dessa resposta em indivíduos com a SMF pode retardar as manifestações da doença no sistema cardiovascular.
Figura 7: Mutações no gene Fbn1 geradas por recombinação homóloga em células ES. A proteína fibrilina está esquematizada. Regiões em cinza correspondem àquelas modificadas nos alelos mutantes. Exons 1, 17 a 28 do gene selvagem (Fbn1wt) estão representados. O alelo mgD consiste na substituição dos exons 18 a 24 pela cassete de expressão neo, o que leva à produção de monômeros de fibrilina com uma deleção interna, porém em baixa quantidade. O alelo mgR é uma inserção dessa cassete no íntron 18 do gene Fbn1, resultando na baixa expressão de fibrilina normal a partir desse alelo. O alelo
Fbn10 é um alelo nulo do gene Fbn1. Nele, parte do exon 1, incluído o códon de início de tradução (ATG) e a seqüência codificadora do peptídeo sinal, foi substituída pelo gene repórter da fosfatase alcalina humana (hFA) e a cassete de expressão neo. O gene hFA fica colocado sob controle do promotor do gene Fbn1 (seta)
Fbn10:
Finalmente, uma terceira mutação no gene Fbn1 foi gerada em nosso laboratório nas células ES USP-1: um alelo nulo (Fbn10) (Figura 7). Para isso, o vetor de recombinação homóloga foi construído de maneira que promovesse uma substitui
ção de parte do exon 1 do gene Fbn1 pelo gene repórter da fosfatase alcalina e pela cassete de expressão neo. Espera-se que a deleção do códon de iniciação de tradução e da seqüência codificante do peptídeo sinal, presentes no exon 1, irá inviabilizar a tradução correta da fibrilina-1. Além disso, a presença do gene repórter da fosfatase alcalina sob controle do promotor endógeno do gene Fbn1 facilitará a análise da expressão temporal e espacial desse gene em animais heterozigotos.
Perspectivas:
Nos últimos 10 anos, células ES de camundongo tornaram-se um poderoso instrumento de pesquisa. Nelas são estudados os mecanismos de diferenciação celular e os eventos iniciais do desenvolvimento embrionário, reproduzidos por essas células diferenciadas in vitro.
As linhagens estabelecidas em nosso laboratório estão sendo utilizadas também para o estudo in vitro do efeito de novas substâncias nesse estágio de desenvolvimento.
Além disso, a capacidade de células ES de se diferenciarem em qualquer tipo de tecido representa um enorme potencial de aplicação médica. Sob condições específicas, induzidas a se diferenciarem in vitro, em um tipo celular determinado,elas poderão, no futuro, ser uma fonte ilimitada de tecidos para transplante no tratamento de doenças. Um passo importante nessa direção foi o estabelecimento de linhagens de células ES humanas (Thomson et al., 1998). Agora, experimentos realizados com células ES murinas poderão ser repetidos e adaptados às linhagens humanas. Finalmente, estamos vivendo o momento histórico do final do seqüenciamento do genoma humano. A análise da primeira versão completa do genoma humano identificou, aproximadamente, 30.000 genes (Lander et al., 2001). Desses,uma grande proporção não tem função conhecida. O grande desafio da era pós-genoma será determinar a função gênica. Uma estratégia poderosa para o estudo de função gênica in vivo é a geração de mutantes. No caso de genes humanos, modelos em camundongos são utilizados devido à nossa capacidade de manipulação do genoma desse animal através da recombinação homóloga em células ES. A implementação desse instrumental de pesquisa no Brasil permitirá seu uso pelos diversos grupos envolvidos no estudo de função gênica.
Figura 6: Caracterização da linhagem USP-1 de células ES. (A) Cariótipo. (B) Análise de atividade de fosfatase alcalina (FA). Grumos de células escuras indicam alta atividade de FA
KERKIS, Alexandre; SOUKOIAN, Marina Et AL. Células tronco Embrionárias . Ciência & Desenvolvimento - nº 20 - maio/junho 2001.
